Adquisición de muestras y análisis de datos
Para establecer un conjunto de datos diacrónicos de la ecología de isótopos estables de la dieta de las tortugas de Galápagos, seleccionamos muestras de cinco fuentes (consulte el Texto complementario): el Museo Americano de Historia Natural, Nueva York, Nueva York, (2) la Academia de Ciencias de California, San Francisco, California, (3) el Museo de Historia Natural, Londres, Inglaterra, (4) el Museo Nacional de Historia Natural, Institución Smithsonian, Washington, DC, y (5) el sitio arqueológico de Thompson’s Cove (CA-SFR-186H) en San Francisco ., California. Proporcionamos detalles sobre la información de procedencia de la muestra y la fecha de muerte como información complementaria. De estas colecciones, obtuvimos muestras de isótopos simples o múltiples de un total de 57 tortugas individuales que representan las siguientes subespecies (n = 10) e islas: cinco C. n. abingdonii (Isla Pinta), uno C. n. becky (Volcán Wolf, Isla Isabela), cinco C. n. chathamensis (Isla San Cristóbal), cuatro C. n. darwini (Isla de Santiago), trece C. n. duncanensis (Isla Pinzón), cuatro C. n. guentheri (Sierra Nega, isla isabela), seis C. n. hoodensis (Isla Española), uno C. n. micrófonos (Volcán Darwin, Isla Isabela), cuatro C. n. Níger (Isla Floreana), nueve C. n. porteros (oeste de la isla de Santa Cruz), una C. n. vicina (Cerro Azul, Isla Isabela), una tortuga desconocida de la Isla Isabela, dos C. n. vicina tortugas que fueron transportadas, vivieron y recolectadas en la isla Rabida, y una tortuga desconocida (Chelonoidis niger ssp.; isla desconocida: la muestra de la fiebre del oro de San Francisco). Las dos primeras tortugas recolectadas en nuestra muestra datan de 1833 y la última tortuga es de 1967, lo que representa un período de 134 años.
Para comprender la variación isotópica específica de tejido y el fraccionamiento con el fin de reconstruir la ecología dietética a largo plazo, tomamos muestras de colágeno de hueso de tortuga (n = 57), apatita de hueso (n = 23), queratina de escudo (n = 8) y piel (n = 8). = 2) para el carbono (δ13Ccolágeno y d13Capatito), nitrógeno (nitrógeno15N), hidrógeno (δD) y oxígeno (δ18Oapatito) isótopos estables. Todas las muestras se taladraron o cortaron con una herramienta rotativa Dremel con una hoja o un accesorio de broca esférica de diamante y se transportaron a la Universidad de Nuevo México, Centro de Isótopos Estables (UNM-CSI), Albuquerque, NM, para su preparación y análisis. Todos los análisis y visualizaciones de datos estadísticos y métricos se realizaron en R (4.0.4) y RStudio (2022.02.4). Proporcionamos un código fuente reproducible complementario al texto.35.
colágeno óseo δ13do, d15N y δD
El análisis de colágeno óseo, piel y queratina de escamas para isótopos estables de carbono, nitrógeno e hidrógeno siguió protocolos estandarizados (por ejemplo, ver36). Para el colágeno óseo, cortamos y desmineralizamos una pequeña porción de hueso a granel en ácido clorhídrico (HCl) 0,5 N a 5 ° C durante 24 h antes de enjuagar todas las muestras hasta la neutralidad con agua desionizada. Para la extracción de lípidos, sumergimos las muestras en una solución de cloroformo:metanol 2:1 (C2H5cl3) durante 24 h (repetido tres veces) mientras también somete a ultrasonido las muestras durante 15 min para garantizar la saturación química completa. La preparación de muestras de queratina de piel y escamas solo se incluyó durante el último paso de extracción de lípidos (es decir, no se requiere desmineralización). Después de 72 h, enjuagamos todas las muestras hasta la neutralidad y liofilizamos las muestras de tortuga durante otras 24 h. Luego medimos aproximadamente 0,5–0,6 mg de colágeno óseo/piel/tejido de escamas en cápsulas de estaño para el carbono (δ13Ccolágeno) y nitrógeno (nitrógeno15N) análisis de isótopos estables. También medimos aproximadamente 0,2–0,3 mg de colágeno óseo/piel/tejido de escamas en cápsulas de plata para el análisis de isótopos de hidrógeno (δD). Reportamos valores de isótopos en notación delta (δ), calculados como: ((Rmuestra/ Restándar) – 1) × 1000, donde Rmuestra y Restándar son las proporciones (por ejemplo, 13C /12C, 15N/14N) del material desconocido y estándar, respectivamente. Los valores delta se reportan como partes por mil (‰).
Las muestras de carbono y nitrógeno se midieron en un analizador elemental Costech 4010 (Valencia, California, EE. UU.) acoplado a un espectrómetro de masas de relación isotópica Scientific Delta V Plus mediante un Conflo IV, y las muestras de hidrógeno se midieron en un analizador elemental de conversión de alta temperatura Finnigan. TC/EA) acoplado a un espectrómetro de masas Thermo Scientific Delta V Plus por un Conflo IV en UNM-CSI (ver37 para obtener detalles sobre el método de conversión a alta temperatura para el análisis de hidrógeno). Todos los datos de isótopos de nitrógeno y carbono se notifican en relación con el N atmosférico2 y V-PDB, respectivamente. Los datos fueron corregidos usando estándares de laboratorio con valores de δ15 N = 6,4 ‰ y δ13C = – 26,5 ‰ (proteína caseína), y de δ15N = 13,3 ‰ y δ13C = – 16,7 ‰ (músculo de atún) que han sido calibrados en relación con los estándares universalmente aceptados: IAEA-N1, USGS 24, IAEA 600, USGS 63 y USGS 40.
Para asegurar el equilibrio entre el hidrógeno intercambiable en las muestras de tejido y la atmósfera local38, pesamos los estándares de hidrógeno y las muestras en cápsulas de plata y dejamos que ambos reposaran en el laboratorio durante al menos 2 semanas antes del análisis. Los datos de hidrógeno se corrigieron utilizando tres estándares de queratina de laboratorio UNM-CSI (δDno ex = – 174 ‰, – 93 ‰ y – 54 ‰) de los cuales δDno ex los valores se determinaron previamente a través de una serie de experimentos de intercambio atmosférico. Estos estándares también fueron calibrados a los estándares USGS CBS y KHS con valores de – 178.8 ‰ y – 47.5 ‰, respectivamente (ver39,40 para detalles y valores actualizados). Para cuantificar cualquier error impartido a nuestros datos de colágeno a través de la corrección con estándares de queratina, una vaca UNM-CSI (Bos tauro) se analizó el estándar de colágeno óseo en cada ciclo durante un período de 6 meses (julio de 2017 – enero de 2018) y dio una desviación estándar entre ciclos de 3,9 ‰, lo que sugiere que la diferencia en el porcentaje de hidrógeno intercambiable entre los tejidos de colágeno y queratina no tuvo un impacto significativo nuestros resultados. Todos los datos de isótopos de hidrógeno se informan en relación con el agua oceánica media estándar de Viena (V-SMOW). El h3 el factor estuvo entre 8 y 8.5 para todas las corridas.
La precisión del colágeno (desviación estándar; DE) para los análisis dentro de la serie es <0,14 ‰ para δ13Ccolágenoy d15N, y ≤ 0,54 ‰ δD. Dado que las proporciones de porcentaje en peso C:N proporcionan una medida de la contaminación por colágeno41y nuestras muestras oscilaron entre 2,7 y 3,5, lo que sugiere colágeno intacto y conservado.
Hueso apatito δ13C y δ18O
Para comprender los isótopos estables de carbono y oxígeno de la apatita ósea (carbonato estructural), homogeneizamos una pequeña muestra de polvo de hueso de tortuga para su análisis siguiendo protocolos estandarizados (p. ej., consulte36). Este polvo homogeneizado se limpió con peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) durante 24 h para eliminar los compuestos orgánicos y luego se enjuagó hasta neutralidad usando agua desionizada y centrifugación. Un segundo tratamiento de ácido acético tamponado 0,1 M (CH3COOH) durante 30 min (seguido de enjuague hasta la neutralidad) para eliminar los carbonatos lábiles. Después del secado, medimos aproximadamente 8,0-10,0 mg de polvo de apatita ósea homogeneizada en viales extainer, lavamos esos viales con He para eliminar el CO atmosférico.2 , y luego se hizo reaccionar la muestra con ácido fosfórico a 50 °C durante al menos 6 h. Esta reacción produjo CO2de carbono (carbono13Capatito) y oxígeno (oxígeno18Oapatito ) análisis de isótopos estables. Todas las muestras se analizaron en UNM-CSI en un Thermo Scientific GasBench (Bremen, Alemania) acoplado a un espectrómetro de masas de relación isotópica Delta Plus con un Conflo II. Un estándar interno de mármol de Carrara (δ13C = 2.0 y δ18O = – 1,8) se analizó en cada ejecución y se usó para corregir los datos. Todos los datos se informan en relación con Vienna Pee Dee Belemnite (V-PDB). La precisión estándar dentro de la serie (SD) es <0,25 ‰ para δ13C y δ18o
Radiocarbono
Enviamos muestras de radiocarbono al Laboratorio de Pruebas Analíticas Beta en Miami, Florida. Beta Analytic preparó submuestras de muestras de colágeno óseo a granel de AMNH-46422 (Beta-599427), AMNH-46424 (Beta-599428) y USNM-84294 (Beta-599425), utilizando protocolos aceptados internacionalmente antes de la medición en un Accelerator Mass Espectrómetro. Los detalles específicos relacionados con la preparación de muestras y los resultados están disponibles en el Texto Suplementario. Las determinaciones de radiocarbono están estandarizadas a la vida media de 5568 años de Libby.
Modelo de mezcla de isótopos estables
Estimación de la proporción de C3 y C4 plantas en las dietas de las tortugas de Galápagos se produjo a través de un modelo Bayesiano Monte Carlo ajustado utilizando consumidores (tortugas), fuentes (plantas) y factores de enriquecimiento trófico (ver27.42). Nuestro conjunto de datos de tortuga de Galápagos no corregida (ver más abajo) δ13C y δ15N isótopos estables funcionaron como datos de consumo para el modelo. Luego extrajimos la planta δ13C y δ15N de Gibbs et al.17. La recolección de estas plantas modernas ocurrió en tres islas: Pinta, Santa Fe y Española (consulte la Tabla complementaria S2), pero usamos estos datos como un indicador de las proporciones de isótopos estables de la vegetación en todo el archipiélago y, por lo tanto, los comparamos con todas las subespecies de tortugas. Las plantas dentro de este conjunto de datos se dividen en dos grupos distintos (C3y C4 ), y tomamos el promedio δ13C y δ15N proporciones de estos grupos para nuestros valores de entrada de origen. Obtuvimos factores de enriquecimiento trófico de tortugas a partir de estudios de alimentación controlados de tortugas.43.44. Se requieren futuros estudios de este tipo específicos para las tortugas de Galápagos para evaluar completamente estos factores (ver45,46).
Suess correcciones
Cambios antropogénicos en el carbono atmosférico (13CO2a 12CO2) debido a la quema de combustibles fósiles impacto δ13proporciones de C; abordar estos requiere una corrección de Suess47. Dado el corto rango temporal de la mayoría de nuestras muestras, en este estudio aplicamos la corrección solo a aquellas muestras anteriores a 1833, es decir, la tortuga de la isla Floreana δ13proporciones de C. Para todas las demás muestras de tortugas y plantas, Suess no corrigió los datos, y se presentan en forma inalterada (consulte la Tabla complementaria S1 para obtener más detalles). Observamos que para las tortugas silvestres no cautivas, la mayor edad calendárica en nuestras muestras es entre 1833 (Floreana y Santa Cruz) y 1929–1934 (Santa Cruz), un período de aproximadamente 100 años, y la corrección de Suess entre 1833 y 1934 es 0,3 ‰. Como la investigación futura se centra en el análisis de las tortugas de Galápagos más recientes, será necesario corregir nuestras proporciones para tener en cuenta los cambios entre, por ejemplo, los siglos XIX y XXI.
